三、填空题
70. 就克隆1个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必须包括____、____、____3个部分。
71. 连接酶催化核酸连接形成____键，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
72. DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段是切割DNA聚合酶Ⅰ得到的分子量为76kD的大片段，具有 ____和____ 两种活性。
73. DNA重组连接的方法大致分为4种____、____、____、____。
74. 一个完整的基因克隆过程包括：目的基因的获取，____的选择与改造，____的连接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选出含目的基因重组DNA的转化细胞。
75. 根据采用的克隆载体性质不同，将重组DNA分子导入细菌的方法有____、____、____及感染。
76. 基因组文库含有组织或细胞的____信息，cDNA文库含有组织或细胞的____信息。
77. 重组DNA分子是由____和____拼接而成。
四、问答题
78. 简述基因克隆及其基本过程。
79. 何谓限制酶？大多数限制酶识别序列的结构特点是什么？
80. 简述目的基因及主要来源和获取途径。
81. 何为质粒？为什么质粒可作为基因载体？
82. 怎样将一个平端DNA片段插入EcoRⅠ限制位点?
83. 什么是蓝白筛选法？
84. 什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？
85. 质粒载体须具备哪些特征？
86. cDNA文库与基因组文库有何不同？
答案
一、选择题
1.A 2.B 3.C 4.B 5.C 6.C 7.C 8.D 9.D 10.C 11.B 12.B 13.B 14.A 15.C 16.C 17.A 18.B 19.B 20.C 21.A 22.B 23.E 24.D 25.A 26.A 27.A 28.D 29.C 30.A 31.B 32.E 33.A 34.C 35.D 36.B 37.E 38.A 39.D 40.B 41.C 42.B 43.D 44.AB 45.BE 46.CD 47.AB
48.BCDE。限制性识别双链DNA中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键，是内切酶。若在识别序列的2个对称点切开DNA双链，则产生带单链尾的粘性末端；若切割点是识别序列的对称轴，则产生平端或钝端。
49.ABCDE。目的DNA来自任何感兴趣的基因，可通过制备基因组DNA、cDNA文库、PCR、人工合成等方法获得。
50.ABC。构建基因文库和cDNA文库是基因克隆(分子克隆、重组DNA技术)的一个过程。
51.ABC。用来克隆和扩增DNA片段的克隆载体应能够导入宿主细胞并在宿主细胞内复制。
52.BDE。参见64-66题。
53.ABCDE。DNA克隆基本程序包括：分——目的基因和载体的获得(DNA的制备和酶解及以mRNA指导合成cDNA等)；接——目的基因和载体的连接；转——重组体的导入(在宿主细胞中生长和繁殖)；筛——重组体的筛选(平板筛选及杂交等技术)。
54.DE 55.AC
二、名词解释
56. 即DNA重组，是将不同来源的DNA分子通过共价连接(磷酸二酯键)形成新DNA分子的过程。
57. 是指通过无性繁殖产生与亲代完全相同的子代群体。
58.简称限制酶或内切酶，是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶。
59. 用枯草杆菌蛋白酶将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD两个片段，大片段称为Klenow片段。
60. 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆群，称为基因文库。
61. 是指所要研究或应用的基因，也就是需要克隆或表达的基因。
62. 以mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的cDNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。
63. 具备接受外源DNA能力的宿主细胞。
64. 在基因克隆技术中，将质粒DNA及其重组体导入细菌的过程称为转化。
65. 病毒及其重组体导入宿主细胞的过程称为转染。
66. 噬菌体及其重组体导入宿主细胞的过程称为转导。
67. 即多克隆位点，是指紧密排列的具有多种限制酶单一识别序列的一段DNA序列。
68. 是指能在连接酶作用下和目的DNA片段连接、实现目的DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子。
69. 是细菌染色体外的遗传单位，是一种双链环状的DNA分子，存在于宿主细胞质内，独立于染色体外，能自主复制，是常用的克隆载体。
三、填空题
70. 复制起点；选择标记；克隆位点。
71. 磷酸二酯。
72. 5’→3’聚合酶；3’→5’外切酶。
73. 粘性末端连接；平头末端连接；人工接头法；同聚尾连接法。
74. 基因克隆载体；目的基因和载体。
75. 转化；转导；转染。
76. DNA；mRNA。
77. 目的DNA；载体DNA。
四、问答题
78. 以质粒等为载体进行DNA克隆的过程为基因克隆。DNA重组基本过程包括：分——目的基因和载体的获得；接——目的基因和载体的连接；转——重组体的导入；筛——重组体的筛选。
79. 限制酶是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并水解其磷酸二酯键的核酸内切酶。多数限制酶识别的DNA序列呈回文结构。
80. 目的基因是指要研究或应用的基因，也就是需要克隆或表达的基因。其主要来源和获取途径如下表：
来源
可获得
获取途径
基因组文库
所有基因
重组DNA技术
cDNA文库
所有表达基因
逆转录合成cDNA与重组DNA技术
PCR扩增
任一基因
利用DNA模板酶促扩增
人工合成
已知序列且
片段较短的DNA
可在DNA合成仪上合成。
81. 质粒是细菌染色体外的遗传单位，是一种双链环状的DNA分子，是仅能存在于宿主细胞质内、独立于染色体外、可以自主复制的遗传成分。质粒可作为基因载体是因为：①分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数；②具有遗传标志，便于筛选转化细胞；③具有多克隆位点，如果在这些位点插入外源基因，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
82. 化学合成长为10bp含有EcoRⅠ识别位点的DNA片段作为接头，然后与待克隆片段两端连接，如果用EcoRⅠ切割这种连接片段，就会产生EcoRⅠ的粘性末端。这种片段就可以插入任何EcoRⅠ的限制位点。
83. 蓝白筛选法是一种利用蓝色化合物作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。主要是在载体的非必要区插入一个大肠杆菌β-半乳糖苷酶的基因片段lacZ。携带有lacZ的载体转入lac－的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)的平板上可形成蓝色菌落。外源基因插入lacZ(或lacZ基因部分被取代)后，重组子将丧失分解X-gal的能力。转入lac－的宿主菌后，在含有X-gal的平板上可形成白色菌落。
84. 用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD两个片段，大片段称为Klenow片段。具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切酶活性，而失去了5’→3’外切酶活性。
Klenow片段的主要用途有：①补齐双链DNA的3′-端；②通过补齐3′-端使3′-端标记；③在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；④DNA序列分析。
85. ①独立复制：能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数；②有选择标记：具有一个以上的遗传标志，便于对转化细胞进行筛选，如抗生素抗性基因和营养代谢基因等；③有独特的酶切位点：具有多种限制酶单一识别序列，便于目的基因的插入。
86. 同mRNA互补的DNA称为sscDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，利用逆转录酶，首先合成一互补的DNA，即第一链，降解mRNA后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为dscDNA，即cDNA。选用合适的载体，与合成的cDNA重组，导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核基因的一种通用方法。
cDNA文库与基因组文库的主要差别：①基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文库克隆的是编码蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。②基因组文库克隆全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆编码序列，它受发育和调控因子的影响。③基因组文库中的编码基因含有内含子和外显子；而cDNA文库中的cDNA不含内含子。
